声明

本文是学习GB-T 33412-2016 生物制品中羟基柠檬酸的测定高效液相色谱法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们

1 范围

本标准规定了用高效液相色谱法测定保健(功能)类生物制品中羟基柠檬酸含量的方法。

本标准适用于口服液、胶囊、颗粒冲剂等生物制品中羟基柠檬酸的测定。

2 规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

3 原理

试样中羟基柠檬酸用水提取，经离心后，上清液经0.45μm
微孔滤膜过滤，经高效液相色谱分离，紫

外检测器检测，外标法定量，测定羟基柠檬酸的含量。

4 试剂和溶液

除另有说明，本方法使用的试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。

4.1 甲醇：色谱纯。

4.2 磷酸。

4.3 体积分数0.1%磷酸水溶液：准确吸取1 mL
分析纯磷酸，用水稀释并定容至1000 mL。

4.4 羟基柠檬酸标准品(CAS 号：6205-14-7):纯度≥98%。

4.5 羟基柠檬酸标准储备液：准确称取1g(精确至0.001g)经过95℃±2℃干燥2 h
的羟基柠檬酸标准品，加适量水溶解，转移至100 mL
容量瓶中，用水定容，摇匀。羟基柠檬酸标准储备液浓度为10.000 mg/mL。

4.6 羟基柠檬酸标准溶液：使用前，将10.000 mg/mL
的羟基柠檬酸标准储备液用水逐级稀释，制成浓度为1.000 mg/mL、0.500
mg/mL、0.200 mg/mL、0.100 mg/mL、0.010 mg/mL、0.001 mg/mL的羟基
柠檬酸标准溶液。

5 仪器与设备

实验室常规设备及下列各项：

5.1 高效液相色谱仪：配紫外检测器。

5.2 分析天平：感量0.01 g,0.001 g。

5.3 高速离心机：10000 g。

5.4 滤膜：0.45 μm, 水相。

GB/T 33412—2016

5.5 超声波清洗器。

5.6 研钵。

5.7 常用玻璃量器，A 级。

6 试样的制备

6.1 固体试样

从研磨成粉末(胶囊取胶囊内容物)的混匀试样中称量1.0 g 试料(精确至0.01
g), 置于烧杯中，加

水 4 0 mL, 超声波清洗器100 W 超声20 min, 冷却至室温后转移至50 mL
容量瓶，并加水定容。

6.2 液体试样

从试样中准确移取试料1.00 mL, 加水稀释并定容至10 mL。

上述上清液即为试料溶液。

7 分析步骤

7.1 液相色谱参考条件

色谱柱：Atlantis T3Ci₈ 色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm),或相当者；

流动相：0. 1%磷酸水溶液+甲醇，体积比(99+1);

流量：0.6 mL/min;

柱温：室温；

检测波长：210 nm;

进样量：10μL。

7.2 绘制标准曲线

分别吸取羟基柠檬酸系列标准溶液，用0.45 μm
滤膜过滤，注入高效液相色谱仪，进样10μL, 进行
测定，以各标准溶液浓度峰面积为纵坐标，以标准溶液标准浓度值为横坐标，绘制标准曲线，并关联获得
标准曲线公式，标准曲线的相关系数应该不小于0
.999。羟基柠檬酸标准品色谱图参见附录 A 中

图 A. 1。

7.3 样品分析

吸取试料溶液(6.2),用0.45 μm
滤膜过滤，注入高效液相色谱仪，在7.2相同条件下进行测定。根

据色谱峰面积，利用线性回归方程计算试料溶液中羟基柠檬酸的含量。典型样品色谱图参见图
A.2。

8 结果计算

8.1 固体试样

固体试样中羟基柠檬酸的含量(质量分数)按式(1)和式(2)计算：

style="width:1.28006in;height:0.59334in" />

style="width:1.32663in;height:0.63338in" />

…………………………

(1)

(2)

style="width:1.36675in;height:0.62656in" />GB/T 33412—2016

式中：

p 从标准曲线求得试料的质量浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL);

A—— 试料的色谱峰面积(高);

a — 标准曲线截距；

b —— 标准曲线斜率；

70 样品中被测组分质量分数，单位为毫克每克(mg/g);

V—— 试料溶液定容体积，单位为毫升(mL);

m;——称取试料的质量，单位为克(g)。

8.2 液体试样

液体试样中羟基柠檬酸的浓度按式(3)计算：

…

式中：

p:— 试样中被测组分质量浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL);

V;— 移取试料的体积，单位为毫升(mL)。

………………

(3)

9 方法特性

9.1 测定范围

进样10μL,
在相关系数大于或等于0.999的前提下，羟基柠檬酸的线性测量浓度响应范围为

0.001 mg/mL～1.000 mg/mL。

9.2 回收率和精密度

参见附录 B。

GB/T 33412—2016

附录 A

(资料性附录)

色谱图

羟基柠檬酸(HCA) 标准品色谱图，见图A.1。

style="width:5.92014in;height:4.46006in" />

1/min

图 A.1 羟基柠檬酸标准品色谱图

典型样品色谱图，见图 A.2。

style="width:5.89339in;height:4.5265in" />

l/min

图 A.2 典型样品色谱图